- 低分子柑橘果膠對結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑敏感性的影響
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低分子柑橘果膠對結(jié)腸癌細胞奧沙利鉑敏感性的影響
汪峰 劉海鷹
實用醫(yī)學(xué)雜志2011年第27卷第21 期
摘要 目的：比較奧沙利鉑單藥及聯(lián)合低分子柑橘果膠（LCP）體外抑制結(jié)腸癌細胞的增殖效應(yīng)，探討LCP是否影響人結(jié)腸癌細胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性。方法：不同濃度的奧沙利鉑單藥及聯(lián)合LCP作用于對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細胞HT29、HCT116、SW116、SW480，通過形態(tài)學(xué)觀察、四甲基偶氮唑鹽法（MTT）細胞活力測定等檢測對人結(jié)腸癌細胞敏感性的影響。結(jié)果：不同濃度的奧沙利鉑對結(jié)腸癌細胞的生長均有抑制作用，而不同濃度的LCP抑制作用不明顯，LCP與奧沙利鉑聯(lián)合作用于人結(jié)腸癌細胞可增強奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細胞的抑制效果。結(jié)論：LCP能增加奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細胞的敏感性，為將LCP推向結(jié)直腸癌治療的臨床試驗和提高結(jié)直腸癌療效提供理論依據(jù)。
關(guān)鍵詞 結(jié)腸腫瘤；奧沙利鉑；低分子柑橘果膠； 化療增敏
結(jié)腸癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國，近幾年結(jié)腸癌成為發(fā)病率上升最快的癌癥之一。除手 術(shù)治療外，內(nèi)科治療在結(jié)腸癌治療中起重要作用。但以目前臨床治療效果來看，大劑量應(yīng)用化療對機體的不良反應(yīng)明顯增加，同時極易產(chǎn)生化療藥 物的敏感性下降和耐藥。因此，尋找可增強化療藥 物敏感性的藥物極為重要。半乳凝集素－3（Gal-3）蛋白是一種重要的腫瘤相關(guān)蛋白，它能通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制細胞凋亡，降 低鉑類藥物化療敏感性。本課題旨在探討Gal-3配體的競爭性抑制劑——低分子柑橘果膠（LCP）是否具有奧沙利鉑的增敏作用，以期為結(jié)腸癌的臨床治療提供指導(dǎo)。
材料與方法
1.1一般資料 人結(jié)腸癌細胞HT29、HCT116、SW116、SW480獲贈于廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心。RPMI-1640培養(yǎng)液、新生小牛血清、0．25％胰蛋 白酶（美國Gibco）；四甲基偶氮唑鹽（MTT上海華 舜）；二甲基亞砜（DMSO美國Sigma）；Gal-3兔多克隆抗體（B2C10美國SANTACRUZ）；抗兔二抗（美國CST）。奧沙利鉑（樂沙定）；LCP（美國圣特 萊）；SynergyTMMx多功能酶標(biāo)儀（美國BioTek）；二氧化碳培養(yǎng)箱（英國Thermo）。
1.2方法
1.2.1 細胞培養(yǎng) 4種人結(jié)腸癌細胞均為貼壁細胞，將細胞置于10％新生小牛血清和青鏈雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37℃、5％CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞單層貼壁生長，待長至80％～90％細胞發(fā)生融合時，用含0．25％的胰酶和0．02％EDTA消化細胞傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞用于實驗。1.2.2 Westernblot分析Gal-3蛋白的表達取對數(shù)生長期的上述4種細胞，消化成5×103／mL的單細胞懸液，提取細胞總蛋白，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞3次，加入裂解液，冰上作用20min，4℃、12000r／min離心10min。上清液保存于－20℃。采 用Bradford法測定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜。37℃封閉 90min，加一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗后加入二抗，37℃搖床混合1h，洗膜后加入增強化學(xué)發(fā)光 底物，檢測雜交信號。
1.2.3 MTT實驗檢測細胞增殖收集對數(shù)生長期的細胞，制備成5×103／mL的細胞懸液，每孔100μL 接種于96孔板，邊緣孔用無菌PBS填充。37℃、5％CO2培養(yǎng)24h，實驗分組，加入不同濃度的藥物 100μL，每孔終體積為200μL。各組藥物濃度：（1）奧沙利鉑組：256、128、64、32、16、8μmol／L；（2）LCP組：0．25、0．5、1、2、4、8mg／mL；（3）聯(lián)合組：單藥組奧沙利鉑＋5mg／mLLCP（預(yù)實驗LCP對細胞增殖抑制呈劑量依賴性，常溫下LCP完全溶解時濃度為5mg／mL）；（4）空白對照組：加入 100μL培養(yǎng)基。各藥物濃度設(shè)6個復(fù)孔。72h后各孔加入5mg／mL的MTT試劑20μL，繼續(xù)孵育4h，棄上清，加入DMSO150μL，室溫下震蕩溶解 10min，待紫色結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測定570nm 波長吸光度值。重復(fù)3次。細胞抑制率（％）＝（1－實驗組平均OD值／對照組平均OD值）×100％ 1.2.4 繪制生長曲線 細胞培養(yǎng)過程同上，實驗分組。各組藥物濃度為：（1）單藥組：IC50濃度奧沙利鉑；（2）聯(lián)合組：IC50濃度奧沙利鉑＋5mg／mL LCP；（3）空白對照組：100μL培養(yǎng)基。每孔200μL，每組各設(shè)6個平行孔，于37℃、5％CO2培養(yǎng)0～5d，每天取1塊96孔板酶標(biāo)儀上測定570 nm波長光密度值。使用GraphPadPrism5軟件繪制生長曲線。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果用x±s表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.結(jié)果
2.1Westernblot分析Gal-3蛋白的表達 Gal-3是半乳凝素家族的一員，廣泛分布于各種正常細胞及腫瘤細胞。W-B分析表明，4種人結(jié)腸癌細胞均表達該蛋白（圖1）。
2.2 MTT法檢測LCP對人結(jié)腸癌細胞增殖抑制效應(yīng) LCP在體外對4種人結(jié)腸癌細胞均有增殖抑制作用，該抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。因高濃度的LCP無法溶解，無法求出IC25及IC50值。本實驗 聯(lián)合組均給予常溫下LCP最高溶解濃度5mg／mL （表1）。
2.3MTT法檢測奧沙利鉑單藥及聯(lián)合LCP對人結(jié)腸癌細胞增殖抑制效應(yīng)奧沙利鉑對4種人結(jié)腸癌細胞的IC50值分別為：HCT11634．00μmol／L、HT29 14．73μmol／L、SW11627．68mol／L、SW48022．26 mol／L。聯(lián)合LCP后，各濃度組奧沙利鉑對人結(jié)腸癌 細胞的抑制作用更加明顯，兩組間各濃度細胞增殖抑制率具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．05）。見表2。
2.4繪制生長曲線觀察奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥作用后細胞增殖情況根據(jù)連續(xù)0～5d的MTT 測試結(jié)果，繪制生長曲線（圖2）。與空白對照組相比，用藥組具有顯著的細胞抑制作用。聯(lián)合用藥組較單藥組細胞增殖能力降低更加明顯，具有統(tǒng)計 學(xué)意義（P＜0．05），兩用藥組間差異隨時間增加。
2.5倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化正常生長的結(jié)腸癌細胞均于2h開始貼壁，24h處于對數(shù) 生長期。細胞貼壁牢固，折光性好，胞質(zhì)透亮，細胞較清晰。鏡下觀察IC50濃度奧沙利鉑單藥作用后72h的細胞形態(tài)，各細胞系均出現(xiàn)細胞貼壁減少，細胞圓縮，胞質(zhì)內(nèi)可見較多顆粒，折光性差。聯(lián) 合組該現(xiàn)象更加明顯，并出現(xiàn)細胞間隙增寬，懸浮 細胞比例增加且碎片多見。
3.討論
奧沙利鉑是結(jié)腸癌化療的主要藥物之一，在其治療結(jié)腸癌的過程中，腫瘤細胞能夠通過一系列機制降低化療敏感性，致使耐藥產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，Gal-3是一種重要的腫瘤相關(guān)蛋白，它是鉑類藥物化療敏感性降低及耐藥形成的主要機制之 一。Hsu等［1］證實鉑類藥物能誘導(dǎo)細胞核內(nèi)的Gal-3 磷酸化并轉(zhuǎn)運至胞漿內(nèi)，后者抑制Bad蛋白的表 達和功能并誘導(dǎo)其112位上的絲氨酸磷酸化，穩(wěn) 定線粒體膜電位，抑制細胞色素C釋放和caspase-3活化，從而起到抗凋亡和增加耐藥性作用。Oishi［2］、Wongkham等［3］分別在高表達Gal-3的卵 巢透明細胞癌與膽管癌研究中證實，應(yīng)用小分子 干擾RNA轉(zhuǎn)染敲除Gal-3，可明顯增加上述細胞對鉑類藥物的敏感性和凋亡比例。
LCP是一種從柑橘類水果的果皮及果漿中提取出的水溶性多糖類化合物，經(jīng)過高pH及高溫處理后具有抗黏附和促凋亡的作用。其抑制腫瘤細胞黏附與轉(zhuǎn)移的作用已明確［4］。本課題組既往研究亦證實，該藥物能有效抑制小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移［5］。其他研究中，Chauhan等［6］研究顯示通過抑制Gal-3的功能，LCP能逆轉(zhuǎn)多發(fā)性骨髓瘤細胞對硼替佐米的耐藥性，并增強其對地塞米松誘導(dǎo)凋亡的反應(yīng)性；Johnson等［7］亦證明LCP能顯著增加血管肉瘤細胞對多柔比星所誘導(dǎo)凋亡的敏感性。作為Gal-3配體的競爭性抑制劑，LCP具有通過封閉Gal-3的結(jié)合位點阻斷其生物學(xué)功能，增加細胞毒性藥物所誘導(dǎo)的凋亡，明顯提高常規(guī)化療效率的潛力。目前國內(nèi)外尚未有LCP與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)直腸癌的文獻報道，故本實驗首次聯(lián)合二者對結(jié)腸癌細胞進行增殖抑制實驗，探討LCP 是否影響人結(jié)腸癌細胞對化療藥物奧沙利鉑的敏感性。
本研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑在體外對4種人結(jié)腸癌細胞均有明顯的增殖抑制作用，其抑制效應(yīng)具有劑量依賴性。LCP與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同效 應(yīng)，能夠使奧沙利鉑對人結(jié)腸癌細胞的抑制作用顯著增加。我們推測，該增敏作用可能與LCP抑制細胞Gal-3蛋白對鉑類藥物的拮抗作用有關(guān)。
綜上所述，LCP能夠增加奧沙利鉑的抑制細胞增殖能力。其低毒與無明顯副反應(yīng)的特性，能降 低大劑量化療藥物的使用，減輕機體的損害，可作為鉑類藥物的增敏劑應(yīng)用于臨床，為手術(shù)治療效 果較差的晚期結(jié)腸癌化療提供選擇。
Effect soflow-molecular-weight citrus pectin on the sensitivity of colon cancer cell lines to oxaliplatin WANGFeng，LIUHai-ying．Department of Gastrointestinal Surgery，the Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical College，Guangzhou510095，China
【Abstract】 Objective To compare the effect of oxaliplatin solo and the combination of oxaliplatin and lowmolecular-weight citrus pectin （LCP） on the proliferation of colon carcinoma cell lines in vitro， and investigate whether LCP would influence the sensitivity of these cells to oxaliplatin． Methods Human colon carcinoma cell lines HT29， HCT116， SW116， SW480 were subjected to oxaliplatin or oxaliplatin plus LCP in various
concentrations for 72 h， and the sensitivity of these cells to oxaliplatin was tested by cell morphology observation and activity testing by MTT． Results There was suppressing effects of different concentrations of oxaliplatin on human colon carcinoma cell lines HT29， HCT116， SW116， SW480． LCP could strengthen the inhibiting effect of oxaliplatin on human colon carcinoma cell lines． Conclusion LCP could increase the sensitivity of human colon carcinoma cell lines to oxaliplatin.
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