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小鼠結(jié)腸腫瘤模型中改性柑橘果膠對肝臟轉(zhuǎn)移的抑制作用

《世界胃腸病學(xué)雜志》2008年12月28日，14卷48號

  翻譯：Tiffany Yang

摘要

目的：探討小鼠體內(nèi)結(jié)腸癌中半乳糖凝集素-3在肝轉(zhuǎn)移中的表達(dá)，并通過改性柑橘果膠（MCP）抑制。

方法：七十五個(gè)BALB/ c小鼠隨機(jī)分為陰性對照組（N= 15），陽性對照組（N= 15），低MCP濃度組（N= 15），中間MCP濃度組（N= 15）和高MCP濃度組（N= 15）。除陰性對照組外，在陽性對照組，低，中，高MCP濃度組中，將CT26型結(jié)腸癌細(xì)胞注入小鼠脾包膜下，以建立一個(gè)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。飲用水MCP濃度分別是0.0％，0.0％，1.0％，2.5％和5.0％（重量/體積）。3周后觀察結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）用于檢測血清中半乳糖凝集素-3的濃度。肝轉(zhuǎn)移中半乳糖凝集素-3的表達(dá)用免疫組化檢測。

結(jié)果： 除陰性對照組外，其他4組肝轉(zhuǎn)移率分別為100％，80％，73.3％和60％。高MCP濃度組肝轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯比陽性對照組（P = 0.008）少。除陰性對照組外，其他4組植入脾臟腫瘤體積中位數(shù)分別為1.51立方厘米，0.93立方厘米，0.77 cm3和0.70立方厘米。中、高MCP濃度組植入腫瘤的體積明顯比陽性對照組（p =0.019，P= 0.003）更小。陽性對照組和MCP治療組血清半乳糖凝集素-3的濃度顯著高于陰性對照組。然而，它們之間沒有顯著差異。除陰性對照組外，其他4組肝轉(zhuǎn)移半乳糖凝集素-3的表達(dá)沒有表現(xiàn)出顯著差異。

結(jié)論：結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中半乳糖凝集素-3表達(dá)的顯著增加可被MCP有效的抑制。

關(guān)鍵詞：果膠;結(jié)腸腫瘤;轉(zhuǎn)移;肝;小鼠

引言

肝轉(zhuǎn)移是影響大腸癌治療效果和術(shù)后預(yù)測的主要原因。抑制肝轉(zhuǎn)移對大腸癌治療效果和術(shù)后預(yù)測是有益的。 半乳糖凝集素-3，一種腫瘤細(xì)胞表面的碳水化合物結(jié)合蛋白，與細(xì)胞間粘附、體外癌細(xì)胞聚集、體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 半乳糖凝集素-3在多種轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)[4]。半乳糖，改良柑橘果膠（MCP）的主要成分，可以專門抑制體內(nèi)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移及體外半乳糖凝集素-3的介導(dǎo)功能[5]。關(guān)于MCP對腫瘤轉(zhuǎn)移抑制作用的研究非常的少。本研究的目的是討論結(jié)腸癌模型中MCP對大鼠肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。

材料和方法

細(xì)胞株

在我們的生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存和傳代培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞株（CT-26），培養(yǎng)在37℃含有10％新出生小牛血清，青霉素G和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含有50 mL / L二氧化碳的5％的CO2培養(yǎng)箱中。

動(dòng)物

這項(xiàng)研究中使用由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（認(rèn)證號：2006A019）提供的七十五個(gè)6-8周齡體重20-25克的BALB/ c雌性小鼠。小鼠無特定病原體。實(shí)驗(yàn)在SPF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

藥品和試劑

MCP是由Centraxinc國際股份有限公司提供（舊金山，美國）。小鼠半乳糖凝集素-3的檢測試劑盒由R＆D公司（明尼阿波利斯，美國）提供。小鼠半乳糖凝集素-3的親和純化聚合酶購自精美生物科技有限公司（中國上海）。

主要設(shè)備

美國比徹組織芯片儀，ST360自動(dòng)酶標(biāo)儀購自科華（中國上海）。

小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立

七十五個(gè)BALB/ c小鼠隨機(jī)分為陰性對照組，陽性對照組，低MCP濃度組，中間MCP濃度組和高MCP濃度組。飲用水中的MCP濃度分別是0.0％，0.0％，1.0％，2.5％和5.0％（重量/體積）。呈指數(shù)增長有足夠NS的CT26細(xì)胞用來混合成懸浮液（1×10⁶/mL）。小鼠腹腔注入4％水合氯醛（10毫升/公斤）麻醉，之后于平行左側(cè)肋下緣腹壁處進(jìn)行切口。隨后進(jìn)行了手術(shù)，將CT-26和0.05毫升懸浮液注入脾。將相同體積的生理鹽水注射到陰性對照組小鼠腹腔中。切口用＃1縫合。手術(shù)后第2天開始到第21天剖檢日所有的老鼠持續(xù)接受溶解MCP的飲用水。給予陰性對照組相同體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)全程所有的老鼠自由接觸食品和水。

觀察

經(jīng)過3周的觀察，小鼠的眼球被移除以收集外周血0.5-1.0毫升。所有的老鼠斷頭處死。腹腔被打開以觀察脾臟原發(fā)性腫瘤并記錄腫瘤的體積和數(shù)量（體積= AB²/ 2，a=****直徑，b =最小直徑）。 如果有超過2個(gè)腫瘤則記錄總體積。肝轉(zhuǎn)移數(shù)量計(jì)數(shù)。所有腫瘤HE染色鑒定。肝轉(zhuǎn)移如前所述被分為4個(gè)等級：0級：無肝轉(zhuǎn)移;Ⅰ級：1-5例肝轉(zhuǎn)移;Ⅱ級：6-10例肝轉(zhuǎn)移;Ⅲ級：超過10例肝轉(zhuǎn)移。

半乳糖凝集素-3的ELISA分析

血液樣本以3000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘以分離血清。分離血清存放在≤-20℃的環(huán)境下。血清樣品以稀釋劑1：20稀釋�？傊�，100μL稀釋液加入到培養(yǎng)皿的每個(gè)反應(yīng)孔中，并在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，培養(yǎng)皿用洗滌液清洗。一百微升檢測抗體被添加到培養(yǎng)皿的每個(gè)反應(yīng)孔中，置于室溫下培養(yǎng)2小時(shí)，培養(yǎng)皿用洗滌液清洗。一百微升的工作稀釋劑鏈霉HRP加入到培養(yǎng)皿的每個(gè)反應(yīng)孔中，培養(yǎng)在黑暗室溫環(huán)境20分鐘，之后清洗培養(yǎng)皿。最后，100μL基質(zhì)溶液添加到培養(yǎng)皿的每個(gè)反應(yīng)孔中培養(yǎng)在黑暗室溫環(huán)境20分鐘，隨后50μL的停止液被添加到培養(yǎng)皿的每個(gè)反應(yīng)孔中。微孔板讀取器用于讀取在450 nm處的吸光度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，用于符合標(biāo)準(zhǔn)樣品的OD值。

肝轉(zhuǎn)移組織芯片

肝組織切片用HE染色以選擇典型的觀察處，如一個(gè)腫瘤豐富的區(qū)域，但要沒有壞死區(qū)和出血。用組織芯片儀來將石蠟塊穿孔（25毫米×25毫米×20毫米）。每個(gè)洞的直徑為1.2毫米，兩洞之間的距離為1.0毫米。五十個(gè)孔被排成10排和5列。用長1.2毫米的穿刺針繪制出顯著典型的組織核心，并把它轉(zhuǎn)移到石蠟塊的某個(gè)位置。 47個(gè)轉(zhuǎn)移樣本被安排到2個(gè)蠟塊中。每個(gè)樣品包括2個(gè)顯著的核心。組織陣列石蠟切片保存在55℃銅板3 0分鐘。輕輕按下石蠟塊來陣列組織內(nèi)核，冷卻于室溫。陣列進(jìn)行切片后迅速預(yù)冷在4℃4小時(shí)。

免疫組織化學(xué)分析

組織樣本切片用半乳糖凝集素-3免疫組化按照半乳糖凝集素-3親和純化多克隆抗體說明染色。部分石蠟切片和水合。用PBS洗滌后，切片以3％過氧化氫在室溫下培養(yǎng)10分鐘，與抗體在室溫下培養(yǎng)10分鐘，與EnVision在室溫下培養(yǎng)30分鐘，最后用DAB染色。結(jié)果由2名病理學(xué)家進(jìn)行雙盲判斷。 半乳糖凝集素-3的表達(dá)水平如前所述分為陰性（ - ），弱陽性（+），陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)都是用SPSS10.0軟件進(jìn)行分析的。腫瘤體積，肝轉(zhuǎn)移數(shù)量，血清和組織中半乳糖凝集素-3濃度都進(jìn)行了非參數(shù)分析測試。

結(jié)果

小鼠的生活狀態(tài)

沒有小鼠在3周實(shí)驗(yàn)期間死亡。一些老鼠被發(fā)現(xiàn)有腫塊，鼓鼓的在腹壁。一些癌癥攜帶小鼠出現(xiàn)精神抑郁的跡象，如減少活動(dòng)，響應(yīng)速度慢，毛發(fā)顏色暗淡，食欲不振（圖1）。

    圖一：結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠模型

＊A.帶有腫瘤的健康小鼠；B. 原發(fā)脾臟腫瘤和肝轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)移性肝癌

除陰性對照組，用高，中，低MCP濃度治療的其他4組肝轉(zhuǎn)移率分別為100％，80％，73.3％和60％。高MCP濃度組的肝轉(zhuǎn)移數(shù)量顯著低于中、低MCP濃度組（P <0.05）（見表1）。

              表一 肝轉(zhuǎn)移

脾臟原發(fā)性腫瘤體積

高，中，低MCP濃度組植入脾臟腫瘤體積中位數(shù)分別是1.51立方厘米，0.93立方厘米，0.77立方厘米和0.70立方厘米。陰性對照組中未發(fā)現(xiàn)腫瘤。 高MCP濃度組的腫瘤體積明顯低于中、低MCP濃度組（P <0.05）（表2，圖2）。

                        圖二

＊ 肝轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌組織切片HE染色（A*200, B*400)

             表二：原發(fā)脾臟腫瘤量

血清中半乳糖凝集素-3的濃度

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸公式計(jì)算血清樣品中半乳糖凝集素-3的濃度，陰性對照組為（14.63±10.08）納克/毫升，陽性對照組為（91.01±22.94）納克/毫升，低MCP濃度組為（82.75±20.33）納克/毫升，中間MCP濃度組為（79.01±17.64）納克/毫升，高MCP濃度組為（85.94±15.52）納克/毫升。結(jié)果表明，陽性對照組和MCP處理組血清中半乳糖凝集素-3濃度顯著高于陰性對照組（P <0.01，表3）。

 表三：半乳糖凝集素－3血清濃度（微克／毫升）

半乳糖凝集素-3在肝轉(zhuǎn)移的表達(dá)

顯微鏡下細(xì)胞液中棕色細(xì)胞被認(rèn)為是陽性細(xì)胞。轉(zhuǎn)移性肝癌組織中陽性細(xì)胞百分率顯示半乳糖凝集素-3在肝臟轉(zhuǎn)移陽性對照組和MCP治療組沒有顯著的差異（圖3，表4）。

                     圖三

＊ 陽性對照組中半乳糖凝集素－3（＊200）的表現(xiàn)(A), 1.0% 濃度MCP(B), 2.5%濃度MCP組(C), 5%濃度MCP組(D)。

             表四：肝轉(zhuǎn)移中半乳糖凝集素－3的表達(dá)

討論

結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移包括腫瘤細(xì)胞滲透，剝離，粘附，聚集和入侵，其中涉及碳水化合物介導(dǎo)的識別蛋白，例如半乳糖凝集素。腫瘤細(xì)胞粘附癌栓和腫瘤細(xì)胞碇泊處粘附血管內(nèi)皮或基底膜是結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。表現(xiàn)在不同階段的半乳糖凝集素在腫瘤進(jìn)程中可能起到至關(guān)重要的作用。 半乳糖凝集素-3是凝集素家族的成員，是一個(gè)多功能的致癌蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長，粘附，增殖和凋亡，以及細(xì)胞間的相互作用和血管生成。大量的證據(jù)已經(jīng)證實(shí)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移顯著表達(dá)半乳糖凝集素-3，半乳糖凝集素-3的高表達(dá)性可在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性病變檢測到，甚至實(shí)在血液中，使得與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移呈現(xiàn)出強(qiáng)勁的關(guān)系。此外，半乳糖凝集素-3的表達(dá)可以用來作為大腸癌的診斷和預(yù)后指標(biāo)。因此，如果半乳糖凝集素-3的功能受阻，粘附和聚集的進(jìn)展可以被打斷，這可能促進(jìn)治療大腸癌和其他癌癥的新藥的開發(fā)。

MCP是一種從柑橘類水果派生的不易消化的水溶性多糖纖維，同時(shí)也是一個(gè)復(fù)雜的富含多糖的半乳糖殘基。 MCP可以特定的抑制碳水化合物結(jié)合蛋白親和配體。當(dāng)MCP的濃度達(dá)到適當(dāng)?shù)乃�平，癌�?xì)胞表面的半乳糖凝集素-3蛋白將幾乎被MCP分子完全阻斷。因此，腫瘤細(xì)胞之間的粘附和聚集將被阻斷。此外，MCP可以通過阻斷半乳糖凝集素-3抑制內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和血管生成，從而攔截癌細(xì)胞從容器和癌癥進(jìn)程吸收營養(yǎng)。然而，沒有證據(jù)說明MCP直接或間接攻擊癌細(xì)胞及有無毒性和副作用。體外實(shí)驗(yàn)表明，MCP能夠抑制癌細(xì)胞粘附層粘連蛋白和同型聚集。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明，口服MCP可以抑制大鼠前列腺癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

我們的研究結(jié)果顯示，MCP可以有效抑制小鼠脾臟植入結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移。高MCP濃度組的肝轉(zhuǎn)移和腫瘤體積明顯比對照組少，

表明MCP可以在一定劑量抑制結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移，這與報(bào)告的數(shù)據(jù)是一致的。相比之下，低MCP濃度組結(jié)腸癌生長和肝轉(zhuǎn)移無顯著差異，這可能是由于缺乏樣本和低非參數(shù)統(tǒng)計(jì)的靈敏度。仍然需要進(jìn)一步的研究來澄清MCP濃度在這方面的作用。

ELISA和免疫組化分析表明，MCP不影響肝轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞中半乳糖凝集素-3的濃度和表達(dá)，但可以抑制體外的肝轉(zhuǎn)移。其機(jī)制可能是MCP只是阻隔癌細(xì)胞表面的半乳糖凝集素-3分子，但不會攔截表達(dá)或腫瘤細(xì)胞的分泌。據(jù)最近報(bào)道，半乳糖凝集素-3的可作為診斷大腸癌的一個(gè)可靠標(biāo)志物，也是癌癥治療中的目標(biāo)蛋白之一。

總之，MCP能通過阻礙腫瘤細(xì)胞的粘附和聚集有效地抑制結(jié)腸癌和肝轉(zhuǎn)移增長。 MCP作為從水果提取的的一種天然多糖和無毒

藥物，可為控制結(jié)腸癌和其他癌癥的生長和轉(zhuǎn)移鋪平了一條新的途徑。MCP和化療藥物聯(lián)合使用以控制和治療結(jié)腸癌肝臟轉(zhuǎn)移的作用仍需要進(jìn)一步研究。

 Inhibitory effect of modified citrus pectin on live metastases

 Abstract
Splanchnic or gastrointestinal ischemia is rare and randomized studies are absent. This review focuses on new developments in clinical presentation, diagnostic approaches, and treatments. Splanchnic ischemia can be caused by occlusions of arteries or veins and by
physiological vasoconstriction during low-flow states.The prevalence of signifcant splanchnic arterial stenoses is high, but it remains mostly asymptomatic due to abundant collateral circulation. This is known as chronic splanchnic disease (CSD). Chronic splanchnic syndrome(CSS) occurs when ischemic symptoms develop. Ischemic symptoms are characterized by postprandial pain, fear of eating and weight loss. CSS is diagnosed by a test for actual ischemia. Recently, gastro-intestinal tonometry has been validated as a diagnostic test to detect splanchnic ischemia and to guide treatment. In singlevessel CSD, the complication rate is very low, but some patients have ischemic complaints, and can be treated successfully. In multi-vessel stenoses, the complication rate is considerable, while most have CSS and treatment should be strongly considered. CT and MR-based angiographic reconstruction techniques have emerged as alternatives for digital subtraction angiography for imaging of splanchnic vessels. Duplex ultrasound is still the first choice for screening purposes. The strengths and weaknesses of each modality will be discussed.CSS may be treated by minimally invasive endoscopic treatment of the celiac axis compression syndrome,
endovascular antegrade stenting, or laparotomy-assisted retrograde endovascular recanalization and stenting.