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通過口服改性柑橘果膠抑制人類癌細(xì)胞的生長和裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移

作者：Pratima Nangia-Makker, Victor Hogan, Yuichiro Honjo, Sara Baccarini, Larry Tait, Robert Bresalier, Avraham Raz                       譯者：Tiffany Yang

美國《國家癌癥研究所》期刊，94卷，第24號(hào)，2002年12月18日          

背景：膳食成分在癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中的作用是一個(gè)有著重要臨床意義的新興領(lǐng)域。許多癌癥的發(fā)展階段都涉及碳水化合物介導(dǎo)的識(shí)別過程。因此，我們研究了高pH值和調(diào)整溫度下柑橘果膠（MCP）的作用，一種不易消化的，水溶性的源于柑橘類水果的多糖纖維，抑制碳水化合物結(jié)合蛋白galectin-3在體內(nèi)的的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，以及體外的半乳糖凝集素-3-介導(dǎo)功能。

方法：將裸鼠通過飲用水喂入MCP，同時(shí)在體內(nèi)注射人類乳腺癌細(xì)胞（MDA-MB-435）到乳腺脂肪墊區(qū)域或者注射人結(jié)腸癌細(xì)胞（LSLiM6）進(jìn)入盲腸，然后研究體內(nèi)的腫瘤生長，血管生成以及轉(zhuǎn)移。通過評(píng)估MCP通過基底膜中人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）對(duì)于毛細(xì)血管形成的效用，可以研究半乳糖凝集素-3-介導(dǎo)在體內(nèi)腫瘤血管生成過程中的功能。MCP對(duì)半乳糖凝集素-3-誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞趨化的影響和對(duì)體外人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MDA-MB-435細(xì)胞粘合物的影響可以分別用Boyden小室和標(biāo)簽檢測的方法來研究。數(shù)據(jù)由兩派學(xué)術(shù)研究：t檢驗(yàn)或費(fèi)雪的保護(hù)最小顯著區(qū)別檢驗(yàn)。結(jié)果：小鼠被喂食MCP后體內(nèi)腫瘤生長，血管生成和自發(fā)轉(zhuǎn)移的情況顯著降低。服用一定劑量的MCP抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)（毛細(xì)管形成）。同時(shí)MCP抑制了半乳糖凝集素-3與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合：在0.1％和0.25％的濃度下，MCP分別抑制了半乳糖凝集素-3（10微克/毫升）與72.1％（P = 0.038）和95.8％（p =.025）的內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。在0.25％的濃度下，MCP抑制了半乳糖凝集素-3（1微克/毫升）與100％（p = .032）內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合。 在一定劑量下MCP抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞趨向半乳糖凝集素-3，在0.005％（P <0.001）時(shí)減少68％，在0.1％（P <0.001）時(shí)完全抑制。最后， MCP還抑制了MDA-MB-435細(xì)胞的粘附，它在一定劑量下將半乳糖凝集素-3暴露于內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)論：通過對(duì)半乳糖凝集素-3的影響，口服MCP能抑制體內(nèi)碳水化合物介導(dǎo)腫瘤的生長，血管生成和轉(zhuǎn)移。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了碳水化合物飲食在預(yù)防或治療癌癥中的重要性。

碳水化合物在生物信息編碼上有巨大的潛力。所有的細(xì)胞在其表面用糖蛋白，糖脂，多糖的形式表達(dá)碳水化合物。凝集素，糖類結(jié)合蛋白，不僅可以區(qū)分不同的單糖，而且還專門綁定低聚糖，檢測復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)中的細(xì)微差別（1）。持續(xù)的增長和隨后的癌癥轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管，碳水化合物介導(dǎo)識(shí)別相互作用也在血管新生中發(fā)揮作用（2）。凝集素的可溶性形式（例如，E-選擇素，血管細(xì)胞粘附分子-1 [VCAM] -1和P-選擇素）在結(jié)合各自的糖綴合物配合基后可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和形態(tài)改變（3）。

癌癥患者血清中的E-選擇素濃度升高的臨床表現(xiàn)為這些分子在癌癥進(jìn)展中的重要性提供體內(nèi)的證據(jù)。然而，這個(gè)前提被一份顯示E-和P-選擇素缺陷小鼠能夠誘導(dǎo)正常的血管生成的報(bào)告質(zhì)疑（8）。因此，我們提前調(diào)查另一個(gè)可溶性糖結(jié)合凝集素，即半乳糖凝集素-3，是否可以提供一種替代的血管通路和顯示依賴碳水化合物的半乳糖凝集素-3結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，誘導(dǎo)體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)和體外血管生成（9）。 半乳糖凝集素-3的所屬的半乳糖凝集素蛋白質(zhì)家族，被定義為一個(gè)共同的碳水化合物結(jié)合域和親和力半乳糖保守序列（10）。

半乳糖凝集素-3的一個(gè)顯著特點(diǎn)是其在腫瘤改造和癌癥發(fā)展中的意義。半乳糖凝集素-3的水平和腫瘤進(jìn)展階段間有一個(gè)直接的關(guān)系。此外，從實(shí)驗(yàn)上來說，半乳糖凝集素-3的單克隆抗體強(qiáng)烈抑制了實(shí)驗(yàn)中肺部B16黑色素瘤的和UV-2237纖維肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移（13）。合成glycoamines FRU-DLeu和紫膠-L-亮氨酸可以作為裸鼠中人乳腺癌癌癥自發(fā)轉(zhuǎn)移的有效抑制劑（14），D-半乳糖和阿拉伯半乳聚糖可以大大抑制L-1實(shí)驗(yàn)性肉瘤細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移的形成（15）。最近，據(jù)報(bào)道，反半乳糖凝集素-3的抗體和乳糖能通過腺癌細(xì)胞株XK4A3和RPMI4788抑制肝轉(zhuǎn)移（16）。這些研究表明了碳水化合物在介導(dǎo)腫瘤治療中的潛力。

果膠是一個(gè)非常復(fù)雜分支的多糖，在半乳糖苷殘留物中富含纖維，而現(xiàn)今也存在于所有植物細(xì)胞壁中。最初據(jù)報(bào)道當(dāng)pH值從酸性到堿性變化時(shí)它結(jié)合致癌物質(zhì)1,2  - 二甲肼（DMH）的效率也越來越高（17）。在其原本的形式下，柑橘果膠（CP）在水中的溶解度有限，無法交互半乳糖凝集素-3，但其改良的形式（MCP）在水解后形成一個(gè)較小的線性水溶性纖維，，它作為一個(gè)半乳糖凝集素-3的配基（18-20）。將黑色素瘤B16-F1細(xì)胞注射入MCP治療的小鼠體內(nèi)會(huì)導(dǎo)致肺定植的顯著減少（19）。此外，注射了前列腺癌癥細(xì)胞株MAT-LyLu的哥本哈根雄性大鼠在口服一定劑量的MCP后減少了自發(fā)性肺定植的情況（18），這表明MCP干擾了循環(huán)中半乳糖凝集素-3-依賴性腫瘤的栓塞，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的減少（18,19）�？诜﨧CP后小鼠植入結(jié)腸腫瘤生長減緩的事實(shí)已被證實(shí)（21）。謝與吳（22）最近報(bào)道，MCP治療能減緩人類前列腺JCA-1細(xì)胞的成長和DNA的合成，同時(shí)伴隨著細(xì)胞周期蛋白B，nm23 ，P34和CDC2的降低，不易消化的膳食，不溶于水的糖類纖維在在各種人類癌癥的病因中有著可觀的作用，因?yàn)樗麄冏鳛榛瘜W(xué)預(yù)防劑對(duì)預(yù)防癌癥有重要意義。從實(shí)驗(yàn)室（18-20）和其他（22-26）的數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，碳水化合物飲食能抑制在小鼠實(shí)驗(yàn)性腫瘤系統(tǒng)中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在這里，我們研究體外MCP對(duì)半乳糖凝集素-3-介導(dǎo)功能的作用和對(duì)裸鼠體內(nèi)的血管生成，腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。

材料與方法

細(xì)胞株和文化

從美國菌種保藏中心（ATCC，馬納薩斯，弗吉尼亞州）購買了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞）。轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435是由埃里克·W·湯普森博士贈(zèng)送的（圣Vincentâ醫(yī)學(xué)研究和墨爾本大學(xué)研究所，墨爾本，澳大利亞）。 LSLiM6是一個(gè)很有特點(diǎn)的從低轉(zhuǎn)移性LS174T衍生出來的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸腺癌細(xì)胞系（27,28）。內(nèi)皮細(xì)胞在哈馬的F12K培養(yǎng)基（歐文科學(xué)，加利福尼亞州歐文）中培育出來，輔以100克/毫升肝素（西格瑪化工有限公司，圣路易斯，密蘇里州），50克/毫升內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑（協(xié)同生物醫(yī)藥產(chǎn)品，貝德福德，碩士），10％胎牛血清（FBS的;首腦會(huì)議生物技術(shù)，柯林斯堡，一氧化碳）。 MDA-MB-435 和LSLiM6細(xì)胞保存在含10％熱滅活胎牛血清（FCS）必要的和不必要的氨基酸（Invitrogen公司），維生素，抗生素（敏達(dá)公司，赫恩登，VA）的Dulbeccoâ的極小基底介質(zhì)中（Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA）。

    細(xì)胞保持在有95％的空氣和5％的二氧化碳的溫度為37°C的加濕室。細(xì)胞生長匯合，然后從2毫米EDTA和0.25％單層胰蛋白酶分離。細(xì)胞株的運(yùn)用得到了人力調(diào)查委員會(huì)，韋恩州立大學(xué)（底特律，MI）的批準(zhǔn)。

為收集條件培養(yǎng)基，細(xì)胞接種至一個(gè)60毫米碟子的匯合處。 24小時(shí)后培養(yǎng)基移除，細(xì)胞用phosphatebuffered洗滌液（PBS）徹底洗滌，允許在無血清培養(yǎng)基中生長。24小時(shí)后培養(yǎng)基被收集起來，通過10K分子量被剔除的Ultrafree-MC離心過濾單位（Millipore公司，貝德福德，馬薩諸塞）來離心分離從而濃縮了20倍，通過西方blot分析來分析半乳糖凝集素-3的存在。

重組半乳糖凝集素-3的制備和改良柑橘果膠

重組人類半乳糖凝集素-3表現(xiàn)在大腸桿菌中，被親和層析柱用前面描述的無唾液酸胎球蛋白柱分離（29）。 柑橘果膠購買自Sigma公司; pH值和溫度的改良如描述（19）。簡言之，柑橘果膠被溶解成含1.5％柑橘果膠的蒸餾水溶液，其pH增至10.0，伴著NaOH（3N）放在50-60°C一小時(shí)。然后把溶液冷卻到室溫，用3N HCI把它的pH值調(diào)整至3.0，儲(chǔ)存過夜。第二天樣本用95％的乙醇沉淀，溫育在-20°C 2小時(shí)，過濾，用丙酮洗滌，用濾紙過濾器烘干。對(duì)于裸鼠喂食，1％的MCP溶液融入滅菌水中，其pH值調(diào)整到約7.0，溶液（500毫升）使用馬克伽馬射線1-68輻照（JL牧羊人＆Associates的格倫代爾，加利福尼亞）以552拉德/分鐘的頻率消毒照射45分鐘。

CP和MCP的成分分析

喬治亞大學(xué)（雅典）的復(fù)雜碳水化合物研究中心進(jìn)行了成分分析。

樣品水解使用新鮮配制1 M鹽酸和3％甲醇，放置在80°C的環(huán)境下16小時(shí)。釋放出的糖被干燥，N-乙酰在45°C使用甲醇和醋酐15分鐘，乙酰樣本為三甲基唾液酸與三銀試劑（皮爾斯，羅克福德，IL）

并用15985 GC-MS系統(tǒng)（惠普，帕洛阿爾托，CA）解析于30-m DB-1柱（J＆W科學(xué)，福爾瑟姆，加利福尼亞州），使用肌醇作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)。

腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移

NCR nu / nu小鼠乳腺脂肪墊區(qū)域被注射了7.5*105個(gè)MDA-MB-435細(xì)胞。該區(qū)域，接種時(shí)間和尸檢都用價(jià)格描述（30）。在開始注射腫瘤細(xì)胞前1周兩組小鼠，每組10只，分別在引用水中添加1％（W / V）的MCP（pH值約為7.0）。兩個(gè)對(duì)照組，每組10只小鼠均保持正常的蒸壓用水。其中一組喂食MCP的對(duì)照組，腫瘤測定每周兩次，持續(xù)了7周，體積用公式計(jì)算（長*寬度1 *寬度2*0.5）。 51天之后，老鼠被麻醉（使用氯胺酮[70毫克/公斤體重]）和甲苯噻嗪[7.5毫克/千克體重]），原發(fā)腫瘤用手術(shù)移除，因?yàn)槠渲幸恍┐笥?.5厘米。小鼠繼續(xù)喂食水或者說MCP溶液8個(gè)禮拜，之后他們因?yàn)轭i椎脫位而死亡。 他們的肺被移除，用Bouinâ固定液固定，使用視覺和微觀觀察腫瘤細(xì)胞集落的形成。

第二組用MCP喂養(yǎng)的小鼠在33天時(shí)被處死。腫瘤被移除，稱重，在PBS中用10％的福爾馬林固定，并將血管用免疫組化染色處理。在33天時(shí)腫瘤被移除，因?yàn)橛行┠[瘤在稍后階段壞死。

MCP抑制人類結(jié)腸癌細(xì)胞從盲腸到肝臟自發(fā)轉(zhuǎn)移的能力如先前所描述的進(jìn)行了測試（28）。我們選擇了結(jié)腸腺癌細(xì)胞株LSLiM6，因?yàn)檫@些細(xì)胞在裸鼠脾門靜脈注射后在盲腸的生長中表現(xiàn)出了很高的肝轉(zhuǎn)移和高肝定植能力（27）。這些細(xì)胞也產(chǎn)生高級(jí)別的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的半乳糖凝集素-3（28）。 在一組10只無病原體裸鼠的飲用水中喂食1％的MCP一周時(shí)間，他們通過吸入甲氧被麻醉，盲腸被形象化，0.1毫升中5×106的可行LSLiM6細(xì)胞被注入盲腸壁。盲腸原位替換，腹部用不銹鋼片封閉。 6周后，處死動(dòng)物，盲腸，腹部腫塊，和肝臟被移除。有宏觀肝癌結(jié)節(jié)的動(dòng)物數(shù)量被測定和比較，對(duì)照組動(dòng)物給予白開水。所有程序的進(jìn)行都是與韋恩州立大學(xué)動(dòng)物調(diào)查委員會(huì)提供的指引相一致的。所有的老鼠都進(jìn)行每天檢查，對(duì)照和治療的小鼠的體重或行為方面沒有區(qū)別。

通過免疫組化分析使血可視化

原發(fā)腫瘤的毛細(xì)血管

為了使從對(duì)照組切除的用MCP喂養(yǎng)的小鼠中原發(fā)腫瘤的血管可視化，這些部分用α平滑肌肌動(dòng)蛋白染色，沾染平滑肌細(xì)胞的血管。免疫組化使用改良的avidin-biotin-過氧化物酶復(fù)合物技術(shù)。簡單地說，4-μm的組織切片脫蠟，復(fù)水，放置在3％的雙氧水中，以抑制內(nèi)源性過氧化物酶。組織切片用0.1％的胰蛋白酶和0.1％的氯化鈣進(jìn)行處理，放置于37°C 3 0分鐘，以暴露被福爾馬林固定屏蔽處的抗原，用3％正常山羊血清封閉1小時(shí)（Sigma化學(xué)公司），隨后1：100稀釋，與單克隆鼠抗人體α-平滑肌肌動(dòng)蛋白一起放置過夜（DAKO公司，Carpinteria，CA）。然后在室溫用生物素標(biāo)記的第二抗體處理30分鐘（Vectastain精英ABC試劑盒;媒介實(shí)驗(yàn)室，伯林蓋姆，加利福尼亞州），之后使用親和生物素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（HRP）的復(fù)雜試劑（根據(jù)的制造商的指示）30分鐘，再用二氨基聯(lián)苯胺（西格瑪化工有限公司）1分鐘。用蘇木進(jìn)行對(duì)比染色。

內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管形成

內(nèi)皮細(xì)胞的毛細(xì)管形成按照前面所述的方法用基底膜檢測（協(xié)同生物醫(yī)藥產(chǎn)品，貝德福德，馬薩諸塞州）（9）。為了準(zhǔn)備凝膠，把200μL的基底膜放在冰上解凍，并添加到八室幻燈片的每個(gè)室中。氣泡小心被移除，幻燈片被轉(zhuǎn)移到37°C孵化器中15分鐘。做成凝膠之后，5 *104內(nèi)皮細(xì)胞胰蛋白酶療法將單層膜分離，并摻200μL培養(yǎng)基接種到凝膠中。在一些室中，將MCP或CP在孵化時(shí)添加到細(xì)胞。血管形成后，觀察16個(gè)小時(shí)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)半乳糖凝集素-3的趨化反應(yīng)

半乳糖凝集素-3-誘導(dǎo)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化反應(yīng)用Boyden小室分析。簡單地說，30 μL的無血清F12K培養(yǎng)基，含10μ克/毫升半乳糖凝集素-3的存在或者沒有不同濃度的MCP被添加到作為趨化因子的下腔。血管內(nèi)皮細(xì)胞（5×104）被添加到上腔。兩腔被聚碳酸酯過濾器（8 - μm孔徑）分離，孵育在37°C。 5小時(shí)后，連接到過濾器較低表面的細(xì)胞使用赫馬3染色集“議定書” （Fisher科技公司，賓夕法尼亞州匹茲堡） 被固定和染色。取自每個(gè)小室的總共10個(gè)領(lǐng)域的細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)，每個(gè)領(lǐng)域的平均細(xì)胞數(shù)被繪制。每個(gè)檢測都一式四份。為了調(diào)查MCP抑制​​趨化的特殊性，使用采用纖維連接蛋白和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）誘導(dǎo)趨化進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。

重組半乳凝素-3的生物素

重組半乳凝素-3是從轉(zhuǎn)化細(xì)菌分離來的，并如前所述純化（29）。蛋白質(zhì)根據(jù)制造商的指示使用EZ-Link的磺酸基-NHS-生物素包（皮爾斯）生物素化。簡單地說，蛋白質(zhì)溶液集中在2毫克/毫升PBS中并混合成30微升磺酸基-NHS-生物素（2毫克/100微升水），從而得到摩爾比為1：20。生物素是由混合物放在冰上培育2小時(shí)得到的。把過量的鹽通過脫鹽列的蛋白質(zhì)溶液從而被移除。餾分收集，確定每個(gè)蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)含量。

半乳糖凝集素-3-內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合分析

內(nèi)皮細(xì)胞以1×104細(xì)胞/孔的密度接種在96孔的板上。 24小時(shí)后，細(xì)胞用PBS洗四次，與不同濃度的MCP一起培養(yǎng)，放在在37°C 100微升無血清F12K培養(yǎng)基中15分鐘。經(jīng)過培育，不同濃度的生物素化重組半乳糖凝集素-3被添加到孔中，于37°C培養(yǎng)2個(gè)小時(shí)。用PBS仔細(xì)的清洗小孔3次。下一步，100微升1：1000稀釋的HRP-標(biāo)記的鏈霉添加到小孔中在室溫培養(yǎng)30分鐘。用PBS洗滌三次把未綁定的蛋白質(zhì)移除。使用100微升檸檬酸緩沖液混合ABTS（2,2 azino-di [3 ethylbenzthiazoline]磺酸）和過氧化氫來展色，在波長為405納米的情況下酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測定檢測酶標(biāo)儀（分子器件，桑尼維爾，CA）。

間接免疫熒光法檢測腫瘤細(xì)胞的半乳糖凝集素-3

MDA-MB-435細(xì)胞胰酶消化并以密度50000個(gè)細(xì)胞/室接種在一個(gè)四室的幻燈片中。經(jīng)過24小時(shí)，細(xì)胞在室溫下與3.4％多聚甲醛固定15分鐘，用含有1％的牛血清白蛋白（BSA）的PBS洗四次。細(xì)胞用含1％BSA的PBS封鎖30分鐘，以1：1稀釋，PBS中含1％BSA之后用原發(fā)性抗體放置4℃培養(yǎng)1小時(shí)（TIB-166大鼠反半乳糖凝集素3單克隆抗體; ATCC）。隨后，細(xì)胞用含0.1％BSA的PBS清洗三次，并以1：50稀釋，用異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG抗體; Zymed，舊金山，加利福尼亞州）培育30分鐘。初級(jí)抗體被省略。該小室脫落幻燈片，細(xì)胞安裝在gelvatol（13％W / V聚乙烯醇-2000，0.6×PBS，30％甘油），在熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本東京）下觀察半乳糖凝集素-3的存在。

半乳糖凝集素-3的免疫印跡分析

為了研究半乳糖凝集素3的表達(dá)式，將血管內(nèi)皮細(xì)胞或MDAMB-

435細(xì)胞胰酶消化，并與臺(tái)盼藍(lán)混合。活細(xì)胞以血球計(jì)數(shù)，細(xì)胞被凍結(jié)在樣品緩沖液中（0.76％磷酸三，10％的甘油，1％十二烷基硫酸鈉[SDS]，1％2 - 巰基乙醇，1％溴酚藍(lán)），5000細(xì)胞/微升。要研究半乳糖凝集素-3的分泌，條件培養(yǎng)基如“細(xì)胞鏈和文化”一節(jié)中所述進(jìn)行了收集和集中。每個(gè)小道含相等的蛋白量（50微克）或溶解細(xì)胞（1×105）。蛋白質(zhì)用12.5％的聚丙烯酰胺分離膠和3.5％的濃縮膠分離，并electroblotted到polyvinylpyrrolidine氟乙烯（PVDF）細(xì)胞膜（微星，韋斯特伯魯，馬薩諸塞州）中。非特異性約束力被封鎖在5％的PBS脫脂干奶1小時(shí)，其次與第一抗體（大鼠的單克隆抗-半乳糖凝集素-3或多克隆-反半乳糖凝集素-3抗體）在室溫下一起培養(yǎng)1小時(shí)。

隨后，將細(xì)胞膜與含0.1％吐溫20的封閉液洗滌五次，并與二抗（分別HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG或山羊抗兔IgG， Zymed）培育 1小時(shí)。如之前一般洗滌后，他們采用電化學(xué)發(fā)光免疫印跡檢測試劑（Amersham公司，皮斯卡塔韋新澤西州）進(jìn)行了增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光處理，根據(jù)制造商的說明找到半乳糖凝集素-3的蛋白。

腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞粘附檢測

MDA-MB-435細(xì)胞用含1％BSA的無血清介質(zhì)在3×106細(xì)胞/毫升的濃度下被凍結(jié)，并用5 μCi的Na51CrO4 CI（杜邦松嫩，波士頓，馬薩諸塞州）放射性標(biāo)記，置于37°C 2小時(shí)。培養(yǎng)末期，細(xì)胞懸浮液被廣泛清洗，一式四份接種在16毫米的含人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞單層的COSTAR培養(yǎng)皿中（康寧，劍橋），含有或不含不同濃度（0.01％，0.05％，0.1％，或0.25％）的MCP。 2小時(shí)后，細(xì)胞用PBS徹底地洗凈，貼壁細(xì)胞用0.1N氫氧化鈉裂解（30分鐘，37°C）。要確定MDA-MB-435細(xì)胞粘附內(nèi)皮細(xì)胞的百分比，細(xì)胞相關(guān)的放射性由Packard自動(dòng)伽瑪計(jì)數(shù)器測定（型號(hào)5650;惠普生物科技有限公司/Perkin Elmer公司， IL）。在無MCP控制實(shí)驗(yàn)中腫瘤細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附度為100％;存在MCP的實(shí)驗(yàn)中附著力相應(yīng)的計(jì)算。

統(tǒng)計(jì)分析

腫瘤的生長，趨化，在體內(nèi)的血管生成，和綁定能力是被測量的主要成果。數(shù)據(jù)由兩個(gè)或三個(gè)置信區(qū)間（CI）在95％的實(shí)驗(yàn)提供。 （實(shí)驗(yàn)都通過不同動(dòng)物重復(fù)進(jìn)行兩次以測定腫瘤的生長。）我們使用學(xué)生的t檢驗(yàn)或Fisher的保護(hù)最小顯著差異檢驗(yàn)（PLSD），使用StatView軟件（Abacus概念，大學(xué)伯克利分校，加利福尼亞州）來分析結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有的統(tǒng)計(jì)雙面檢驗(yàn)，P值小于0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

結(jié)論

要測試MCP抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的能力，7.5×105 MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞被注入一個(gè)星期前開始通過飲用水喂食1％MCP的NCR小鼠乳腺脂肪墊。溶液的pH值調(diào)整到7.0以中和MCP酸味。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)飼喂小鼠MCP。MCP添加到飲用水沒有影響整體致瘤效率。然而，對(duì)照與組小鼠（p =.050，學(xué)生的t檢驗(yàn);圖1）相比，喂食MCP的老鼠腫瘤生長速度顯著減緩。腫瘤接種7個(gè)星期后，對(duì)照組小鼠的腫瘤達(dá)到1.5厘米，迫使我們終止對(duì)所有小鼠的分析。對(duì)照組平均腫瘤體積為552±14mm3（95％CI=540至564 mm3），對(duì)比MCP喂養(yǎng)小鼠的165±48 mm3（95％CI=128至201 mm3）。對(duì)照組和治療組在腫瘤體積控制之間的差異為387mm3（95％CI=363到412 mm3）。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后15周，處死實(shí)驗(yàn)小鼠，尸檢，并檢查腫瘤轉(zhuǎn)移。三只老鼠（一只對(duì)照小鼠和兩只MCP喂養(yǎng)小鼠）在手術(shù)中或手術(shù)后立即死亡;因此，并沒有分析每組全部10只小鼠的轉(zhuǎn)移。喂食MCP組肺轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯比對(duì)照組小許多（分別是8只中的0只和9只中的6只）。各組的代表肺部描繪見圖2。每日飲水量在各組相似。小鼠沒有任何厭惡MCP的表現(xiàn)。治療組動(dòng)物體重和整體行為與對(duì)照組相似。

為了分析MCP是否能抑制其他類型腫瘤的增長，我們還研究了喂食MCP裸鼠的人類結(jié)腸癌細(xì)胞的結(jié)腸增長和自發(fā)轉(zhuǎn)移。此前，我們已經(jīng)表明，半乳糖凝集素-3對(duì)在脾臟門脈或盲腸增長后人類結(jié)腸癌細(xì)胞的肝臟定植起作用（27,28）。因此，我們檢驗(yàn)MCP是否會(huì)影響從盲腸到肝臟這些細(xì)胞的傳播，。五百萬LSLiM6細(xì)胞手術(shù)植入到裸鼠盲腸（MCP喂養(yǎng)和對(duì)照組每組10只老鼠），6個(gè)星期后，經(jīng)過不斷的MCP喂養(yǎng)，處死小鼠，腫瘤被切除，稱重，記錄轉(zhuǎn)移的發(fā)病率。對(duì)照組和1％（W / V）MCP喂食組原發(fā)腫瘤的平均重量分別為1.16克（95％CI-1.13至1.19克）和0.65克（95％CI為= 0.37至0.93克）。

對(duì)照組和MCP喂食組小鼠腹內(nèi)的腫瘤重量分別為2.0克（95％CI=1.94至2.06 克）和0.88克（95％CI=0.37至0.93克）。對(duì)照組和治療組原發(fā)腫瘤重量之間的區(qū)別為0.51克（95％CI=0.40至0.82克）。對(duì)照組和MCP組腹內(nèi)腫瘤重量差異為1.12克（95％CI=1.01至1.69克）。對(duì)照組轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)和肝臟的分別為100％（9只中的9只）和60％（10只中的6只），對(duì)比MCP喂食組的25％（8只中的2只）和0％（9只中的0只）。類似的結(jié)果在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中觀察到。所有組別中每日水的攝入量是相似的。對(duì)照組和治療組的動(dòng)物體重和整體行為不變。

以前我們已經(jīng)證明，半乳糖凝集素-3介導(dǎo)體內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和體外依賴碳水化合物生成血管（9）。因此，我們調(diào)查MCP對(duì)腫瘤生長的抑制效果是否與減少血管生成有關(guān)。生長在水或MCP喂養(yǎng)裸鼠（每組5只）乳腺脂肪墊中的原發(fā)MDA-MB-435腫瘤被切除，固定，染色來研究血管的存在。每單位面積MCP喂養(yǎng)小鼠的腫瘤是對(duì)照組小鼠腫瘤數(shù)量的三分之一（圖3）。從每組提取的三個(gè)腫瘤切片，每一個(gè)幻燈片的一個(gè)領(lǐng)域?qū)Ρ让總�(gè)腫瘤的三個(gè)幻燈片計(jì)數(shù)血管的生成。對(duì)比組和治療組平均血管數(shù)（和95％CI）分別為15.0（95％CI為12.9至17.2）和4.9（95％CI為3.0至6.7）。為了直接測試MCP對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)的影響，進(jìn)行了一項(xiàng)體外毛細(xì)管形成的測定。通過在37°C培養(yǎng)15分鐘，八室幻燈片的每室都形成了薄薄的一層基底膜。然后把五萬內(nèi)皮細(xì)胞接種于各室，同時(shí)加入不同濃度的MCP或CP。觀察MCP組在一定劑量下抑制細(xì)胞在基底膜建立毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)的能力（圖4，B-D），同時(shí)對(duì)比對(duì)照組PBS（圖4，A）和完整的CP控制（圖4，E和F）。

趨化是血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移不可分割的一部分（31）。和堿性成纖維細(xì)胞生長因子一樣，半乳糖凝集素-3誘導(dǎo)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有趨化反應(yīng)（9）。以確定MCP是否能抑制半乳糖凝集素-3-誘導(dǎo)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化，我們進(jìn)行Boyden小室趨化實(shí)驗(yàn)。作為趨化因子，在無血清培養(yǎng)基中的半乳糖凝集素3（10微克/毫升）含有不同濃度的MCP被放置在較低的葉片上，和血管內(nèi)皮細(xì)胞（5×104個(gè)細(xì)胞）被裝入上腔。經(jīng)過5個(gè)小時(shí)在37°C的培養(yǎng)，向趨化因子遷移的細(xì)胞被固定，染色，放于相位對(duì)比顯微鏡下計(jì)數(shù)（圖5，A）。 MCP依賴一定劑量下對(duì)抑制對(duì)半乳糖凝集素-3的趨化反應(yīng)有顯著作用。在濃度為0.005％（W / V）時(shí)，趨化性減少了68％。在濃度為0.1％（W / V）的時(shí)候，趨化性被完全抑制，與陰性對(duì)照組有相同數(shù)量的遷徙細(xì)胞。下一步，我們通過分析存在MCP時(shí)纖維連接蛋白和堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的趨化性，調(diào)查MCP的影響是否具體到針對(duì)半乳糖凝集素-3的趨化反應(yīng)。 MCP（在濃度為0.05％的時(shí)候）對(duì)纖維連接蛋白誘導(dǎo)的遷移有很少的抑制作用（抑制26％），可以強(qiáng)烈的抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的趨化（在濃度分別為0.01％和0.05％的時(shí)候，抑制34％和86％）（圖5，B）。使用費(fèi)舍爾的PLSD測試計(jì)算P值，半乳糖凝集素-3為0.016，含0.001％的MCP，或小于0.001，MCP含量分別為0.005％，0.01％和0.1％;對(duì)纖維連接蛋白來說，在MCP為0.01％和0.05％時(shí)，P值分別為0.122和.007;對(duì)于堿性成纖維細(xì)胞生長因子，在MCP分別為0.01％和0.05％時(shí)，P值分別為.015和小于0.001。

之前我們已經(jīng)證實(shí)，半乳糖凝集素-3結(jié)合到內(nèi)皮細(xì)胞表面的高與低親和力受體（9），該結(jié)合專門促發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)管的形成。為了確認(rèn)MCP是否能抑制這種結(jié)合，1×104內(nèi)皮細(xì)胞接種在96孔板并和不同濃度的MCP在37°C孵育15分鐘。之后加入生物素半乳糖凝集素-3（1 微克 /毫升和10微克/毫升），在37°C培養(yǎng)2小時(shí)后，細(xì)胞被徹底清洗，結(jié)合的效率是由ABTS和H2O2的顏色發(fā)展決定的。結(jié)果（圖6）表明，galectin-3會(huì)結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞，而MCP專門抑制這種結(jié)合。類似的實(shí)驗(yàn)分別用CP，乳糖，蔗糖操作;抑制只發(fā)生于乳糖和MCP，蔗糖或CP沒有發(fā)生（數(shù)據(jù)未顯示）。在MCP濃度為0.1％和0.25％時(shí)，10 μg / mL的半乳糖凝集素-3與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合分別被抑制了72.1％和95.8％，當(dāng)MCP 濃度為0.25％時(shí)，1μg / mL的半乳糖凝集素-3與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合被100％抑制。（當(dāng)MCP濃度為0.1％和0.25％，1 μg / mL galectin-3濃度時(shí)，使用費(fèi)舍爾的PLSD測試的P值分別為0.045和0.032。當(dāng)MCP濃度為0.1％和0.25％，10 μg / mL 半乳糖凝集素-3濃度時(shí)， P值分別為0.038和0.025）。西方雜交和直接免疫熒光分析表明，MDA-MB-435細(xì)胞能表達(dá)細(xì)胞表面上和細(xì)胞質(zhì)里的半乳糖凝集素-3，并分泌它（圖7）。隨著MCP劑量的增加，如分別為0.01％，0.05％，0.1％和0.25％，MCP對(duì)腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合（附著力）的抑制有一個(gè)漸進(jìn)的作用（33％，58.4％，66.5％和83.4％）（圖8）。由費(fèi)希爾PLSD試驗(yàn)計(jì)算的P值，當(dāng)MCP濃度為 0.05％，0.1％和0.25％時(shí)小于0.001 ，當(dāng)MCP0.01％時(shí)為P值為0.003。因此，MCP對(duì)腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的抑制能會(huì)影響粘合作用，這在侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

討論

膳食成分的使用對(duì)于保護(hù)和/或預(yù)防癌癥的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的作用是研究的一個(gè)重要新興領(lǐng)域。尋找新的食物補(bǔ)充劑并了解它們的作用機(jī)制是使用功能性食品作為癌癥治療方式的主要挑戰(zhàn)。

    先前的研究顯示，果膠水解，是否口服（18）或靜脈注射（19），都降低了自發(fā)和實(shí)驗(yàn)的肺腫瘤細(xì)胞定植。不溶于水纖維形式的CP也可減少化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸癌發(fā)病率（17），想必是通過促進(jìn)雙歧桿菌實(shí)現(xiàn)的（26）。被喂養(yǎng)含15％CP的飲食的大鼠表明了較高結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡指數(shù)（23-25​​）。當(dāng)人類前列腺JCA-1細(xì)胞在含有MCO的媒介中生長，報(bào)告顯示出降低的細(xì)胞生長率和相應(yīng)的[3H]胸腺嘧啶摻入到DNA中的幾率（22）。果膠也被發(fā)現(xiàn)對(duì)硝基化合物具有抗突變活性（32）。每日口服MCP能減少BALB / c小鼠植入結(jié)腸-25腫瘤的生長，膳食果膠減少了來自瘤腫瘤細(xì)胞株TLT和EMT6的肌注移植小鼠腫瘤的增長（33）。目前的研究結(jié)果是首次報(bào)告顯示，一種可溶性，口服攝入的碳水化合物纖維能抑制腫瘤的生長和原位生長乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

數(shù)據(jù)表明，MCP可能通過抑制血管生成減少乳腺和結(jié)腸腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。在裸鼠口頭攝入MCP7個(gè)星期后，在裸鼠乳腺脂肪墊的乳腺腫瘤細(xì)胞里，我們發(fā)現(xiàn)在腫瘤體積平均減少70.2％（圖1）。

與之伴隨著血管減少66％以及對(duì)轉(zhuǎn)移到肺部完全的抑制作用（圖3）。同樣，對(duì)于植入人結(jié)腸癌細(xì)胞（LSLiM6）的裸鼠，與對(duì)照組相比，喂食MCP組有明顯的腫瘤負(fù)擔(dān)的減輕。對(duì)照組淋巴結(jié)節(jié)點(diǎn)和肝臟轉(zhuǎn)移為100％和66％，而MCP喂養(yǎng)小鼠則為25％和0％。

果膠由 “光滑的”和“多毛的”的區(qū)域組成。光滑的區(qū)域由部分酯化的半乳糖醛酸殘基組成，多毛的”的區(qū)域含有半乳糖醛酸殘基，不規(guī)​​則插入鼠李糖殘基，側(cè)鏈則含中性糖，如阿拉伯糖，半乳糖，葡萄糖，甘露糖，木糖。通過pH值將CP改良至MCP包括通過貝塔排除法（高pH）將主要半乳糖醛酸鏈的降解，其次是天然碳水化合物（低pH值）的部分降解，產(chǎn)生了與未改良CP糖類成分基本相同的更簡單的碳水化合物。 CP和MCP成分分析表明MCP的半乳糖，鼠李糖，木糖（數(shù)據(jù)未所示）更豐富。 MCP有效的結(jié)合重組半乳糖凝集素-3，通過阻斷碳水化合物結(jié)合域抑制半乳糖凝集素-3-介導(dǎo)的功能，比如同型腫瘤細(xì)胞聚集，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，貼壁獨(dú)立的增長，以及對(duì)粘連配基的結(jié)合（18-20）。我們的研究結(jié)果表明MCP也作為一個(gè)血管生成抑制劑。在體外實(shí)驗(yàn)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和分化成毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，或者M(jìn)CP阻止這種遷移和毛細(xì)管形成，無論是通過結(jié)合目前矩陣的半乳糖凝集素-3和/或內(nèi)皮細(xì)胞，或干擾其受體結(jié)合。在體內(nèi)，這會(huì)導(dǎo)致腫瘤相關(guān)的血管密度明顯減少。同樣MCP之所以能抑制半乳糖凝集素-3表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-435與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，部分解釋為對(duì)侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用。最近研究結(jié)果表明，血癌轉(zhuǎn)移源自癌細(xì)胞血管增長并附著到內(nèi)皮細(xì)胞，而不是淤血（34）。這表明腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用在癌癥轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。在這里，我們已經(jīng)表明，MCP能抑制半乳糖凝集素-3誘導(dǎo)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的趨化遷移，其他報(bào)道，肝素的存在時(shí)，CP抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子結(jié)合其受體FGFR，也是一個(gè)復(fù)雜的碳水化合物（35）。

總之，我們的研究結(jié)果表明，MCP通過阻隔半乳糖凝集素-3及其受體的結(jié)合抑制體外和體內(nèi)碳水化合物介導(dǎo)血管的生成。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了膳食碳水化合物作為癌癥的預(yù)防和/或治療劑的重要性。碳水化合物的復(fù)雜性使得能識(shí)別血管生成因子和糖綴合物受體的新拮抗劑的發(fā)展十分必要。