MCP、血管內(nèi)皮抑素抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用研究

劉海鷹, 黃志良, 楊國(guó)華

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院腹部外科, 廣東 廣州 510095)

 實(shí)用腫瘤雜志2008年 第23卷 第6期

摘要: 目的 修飾柑橘果膠(modified citrus pectin,MCP) 和血管內(nèi)皮抑素(endo statin, ES) 已分別被證實(shí)能通過(guò)不同機(jī)制抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的形成。探討不同濃度的M CP 及與ES 聯(lián)用后對(duì)小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。方法經(jīng)小鼠脾臟下極包膜注入CT 226 結(jié)腸癌細(xì)胞建立結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。135 只B albƒc 小鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量M CP 組、中劑量M CP 組、高劑量M CP 組、ES 組、低濃度M CP+ ES 組、中濃度M CP+ ES 組和高濃度M CP+  ES 組。M CP 加入飲用水中, 各組濃度分別為0、0、0101、01025、0105、0、0101、01025 及0105 gƒL , ES 劑量均為2 m gƒkg, 腹腔內(nèi)給藥, 隔天1 次。3 周后觀察各組小鼠肝轉(zhuǎn)移情況。制作肝轉(zhuǎn)移瘤組織芯片, 用免疫組化方法檢測(cè)肝轉(zhuǎn)移瘤組織中g(shù)alectin23、V EGF 的表達(dá)和腫瘤微血管密度(M VD ) , 采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(EL ISA ) 方法檢測(cè)小鼠血清galectin23 和V EGF 濃度。結(jié)果    (1) 除陰性對(duì)照組外, 各組肝轉(zhuǎn)移率分別為100.  0%、8010%、7313%、6010%、8617%、7313%、7313% 和6010%。高濃度M CP 組、中濃度M CP+ ES 組、高濃度M CP+ ES 組與陽(yáng)性對(duì)照組比較, 肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目均明顯減少(P <  0105); 高濃度M CP+ ES 組與ES 組比較, 肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯減少(P <  0105)。

(2) 除陰性對(duì)照組外, 各組脾臟種植瘤體積中位數(shù)分別為 1151 cm 3、0193 cm 3、0177 cm 3、0170 cm 3、1125 cm 3、1115 cm 3、0175 cm 3 和0167 cm 3。中濃度M CP 組、高濃度M CP 組、中濃度M CP+ ES 組、高濃度M CP+ ES 組與陽(yáng)性對(duì)照組比較, 脾臟種植瘤體積均明顯縮小(P <  0105)。 (3) 各組肝轉(zhuǎn)移瘤galectin23、V EGF 表達(dá)相互間比較無(wú)明顯差異(P 值均> 0105)。 (4) 陽(yáng)性對(duì)照組和各治療組的血清galectin23、V EGF 濃度均明顯高于陰性對(duì)照組(P 值< 0101);

陽(yáng)性對(duì)照組與各治療組相互間比較無(wú)明顯差異(P 值均> 0105)。 (5) 各組肝轉(zhuǎn)移瘤M VD 分別為 28147±3122、27147±3122、26192±1147 26191±2141、26143±1147、26150±3109、25145±1196 和24173±3109, 各濃度M CP+ES 組肝轉(zhuǎn)移瘤M VD 計(jì)數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較均有明顯減少(P 值均< 0105)。

結(jié)論  單用M CP 或與ES 聯(lián)用均能有效抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移和微血管生成。

關(guān)鍵詞: 結(jié)腸腫瘤; 肝腫瘤ƒ繼發(fā)性; 肝腫瘤ƒ藥物療法; 果膠類; 內(nèi)皮抑素類ƒ治療應(yīng)用; 基因療法

據(jù)統(tǒng)計(jì), 約50% 結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移, 肝轉(zhuǎn)移是影響結(jié)腸癌治療效果和術(shù)后生存率的主要原因, 抑制肝轉(zhuǎn)移有助顯著提高結(jié)腸癌的療效和生存率[ 1 ]。但目前通過(guò)針對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移不同環(huán)節(jié)以抑制肝轉(zhuǎn)移形成的研究不多。研究已證實(shí)M CP 的半乳糖成分能有效阻斷galectin 23 的功能表達(dá)以抑制腫瘤轉(zhuǎn)移形成, 血管內(nèi)皮抑素(ES) 則能通過(guò)抑制新生血管形成限制腫瘤轉(zhuǎn)移的形成。目前未有報(bào)道聯(lián)合使用兩者對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的影響。本研究主要利用結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型, 探討M CP 聯(lián)用ES 對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。

1 材料與方法

111 材料和儀器

11111 細(xì)胞株 小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞株CT 226 由本院生物工程實(shí)驗(yàn)室傳代保存。細(xì)胞使用R PM I21640細(xì)胞培養(yǎng)液(含 10% 新生小牛血清、青霉素 100 U ƒ m l、鏈霉素100 m gƒL ) , 37℃、5% CO 2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

11112 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～ 8 周齡Balbƒc 雌性小鼠135只(由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供, 動(dòng)物合格證號(hào): SCXK 粵2006A 019) , 體重20～ 25 g, 實(shí)驗(yàn)小鼠無(wú)特殊病原菌; 實(shí)驗(yàn)在中心SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

11113 藥物   M CP 由美國(guó)圣特萊公司提供。ES 由煙臺(tái)麥得津生物公司提供。羊抗鼠ga lectin 23、V EGF和CD 34 免疫組化試劑盒均購(gòu)自深圳晶美生物制品公司。

11114 主要儀器 美國(guó)Beecher 組織芯片儀, 多功能倒置相差顯微攝影系統(tǒng)、上�？迫AST 360 全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀。

112 方法

11211 結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立 取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的CT 226 細(xì)胞加入適量生理鹽水配成2× 106 ƒm l 細(xì)胞懸液。4% 水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠 ( 011 m gƒ10  g) , 取左肋緣下平行肋緣切口, 打開腹腔, 在脾臟下極包膜注入CT 226 細(xì)胞懸液0105 m l, 1 號(hào)絲線間斷縫合切口關(guān)腹。135 只小鼠隨機(jī)分為 9組, 每組15 只: (1) 陰性對(duì)照組; (2) 陽(yáng)性對(duì)照組; (3) 低濃度M CP 組(1% ) ;  (4) 中濃度M CP 組(215% ) ; ( 5) 高濃度M CP 組( 5% ) ; ( 6) ES 組;  ( 7) 低濃度M CP + ES 組; (8) 中濃度M CP+ ES 組; (9) 高濃度M CP+ ES 組。全部小鼠術(shù)后第2 天開始藥物實(shí)驗(yàn), M CP 加入飲用水中配成相應(yīng)濃度, ES 隔天腹腔內(nèi)注射 1 次, 對(duì)照組以同等量生理鹽水代替飲用水和注射液。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食。

1.   2.   2 病理觀察 實(shí)驗(yàn)3 周后摘眼球法采集小鼠

外周血提取血清, 引頸法處死小鼠。打開腹腔觀察脾臟有無(wú)病灶, 記錄腫瘤大小和數(shù)目。腫瘤體積V = ab2 ƒ2 (a: 腫瘤****徑; b: 腫瘤最小徑) , 如有多個(gè)腫瘤則計(jì)算體積總和。仔細(xì)觀察肝臟有無(wú)轉(zhuǎn)移灶, 記錄轉(zhuǎn)移灶數(shù)目, 所有轉(zhuǎn)移瘤均經(jīng)病理切片H E 染色證實(shí)。根據(jù)周志偉等[ 2 ] 方法將肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目分為四個(gè)等級(jí)進(jìn)行統(tǒng)計(jì): 0 級(jí): 肝臟無(wú)轉(zhuǎn)移病灶; I 級(jí): 1～ 5 個(gè)轉(zhuǎn)移病灶; " 級(jí): 6～ 10 個(gè)轉(zhuǎn)移病灶; ? 級(jí): >  10 個(gè)轉(zhuǎn)移病灶。

1.   2.   3 肝轉(zhuǎn)移瘤組織芯片制作 復(fù)查H E 及免疫

組化染色切片, 選擇典型癌灶(富有癌細(xì)胞且無(wú)壞死出血的區(qū)域)。用組織芯片儀在預(yù)先準(zhǔn)備好的空白蠟塊(25 mm ×25 mm ×20 mm ) 上按設(shè)計(jì)位置打孔, 孔徑112 mm , 孔間距110 mm , 排成10 行×5 列共50 點(diǎn)微陣列。用112 mm 穿刺針將標(biāo)記好的瘤體組織柱取出, 轉(zhuǎn)移到空白蠟塊的相應(yīng)位置, 將 47 例組織芯安插于兩個(gè)空白蠟塊中, 其中每個(gè)組織芯蠟塊含47 個(gè)組織芯(包括兩個(gè)標(biāo)記點(diǎn))。將制成的組織芯蠟塊面朝下置于銅板上55℃放置30 分鐘, 輕壓模塊使組織柱在模塊上排平, 冷卻至室溫, 蠟塊在4℃×4 h 預(yù)冷后快速進(jìn)行切片修整, 切片待用。

11214 免疫組化方法 對(duì)肝轉(zhuǎn)移瘤組織芯片分別

進(jìn)行g(shù)alectin 23、V EGF 免疫組化染色, CD 34 免疫組化染色采用石蠟切片。所有操作嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說(shuō)明進(jìn)行(EnV isio n 法) , 結(jié)果判斷由兩名病理科醫(yī)師雙盲閱 片。 galectin 23 表達(dá)強(qiáng)度參考San juan 等[ 3 ] 的標(biāo)準(zhǔn), V EGF 表達(dá)強(qiáng)度參考To i 等[ 4 ] 的標(biāo)準(zhǔn), 均分為陰性(- )、弱陽(yáng)性(+ )、陽(yáng)性(+ + ) 和強(qiáng)陽(yáng)性(+ + + )。M VD 計(jì)數(shù)參考W eidner 等[ 5 ] 的方法, 先在低倍鏡下(×40) 確定腫瘤內(nèi)新生血管最密集區(qū)作為“熱點(diǎn)”進(jìn)行血管計(jì)數(shù), 然后在高倍鏡下(×200) 計(jì)數(shù)5 個(gè)視野, 將5 個(gè)視野的血管平均數(shù)作為該切片的微血管密度值(M VD 值)。

11215 EL ISA  實(shí)驗(yàn)方法(雙抗體夾心法) 小鼠外周血離心(3 000  rƒm in×5 m in) 提取血清, 嚴(yán)格按照 EL ISA 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作: 血清以1∶20 稀釋后每孔加入100 Λl, 室溫孵育2 小時(shí), 洗板, 加入工作濃度辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體 100 Λl, 室溫孵育 2 小時(shí), 洗板, 再加入100 Λl 底物四甲聯(lián)苯胺, 室溫避光孵育20 分鐘, 加入50 Λl 終止液, 酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度(OD ) 數(shù)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品OD 值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 根據(jù)回歸方程換算各樣本galectin 23、V EGF 濃度。

113 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 1010 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 脾臟腫瘤體積、肝轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目、肝轉(zhuǎn)移瘤組織galectin 23、V EGF 表達(dá), 血清galectin 23、V EGF 濃度比較和M VD 計(jì)數(shù)比較均采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法。以P< 0105 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

211 小鼠存活情況

實(shí)驗(yàn)3 周內(nèi)無(wú)小鼠死亡。于第2 周后部分荷瘤小鼠外觀可見(jiàn)腹部明顯隆起腫塊, 出現(xiàn)活動(dòng)減少、反應(yīng)遲緩、毛色暗淡、進(jìn)食減少和精神萎靡等衰竭現(xiàn)象

(見(jiàn)圖1)。

212 肝臟轉(zhuǎn)移瘤數(shù)目

實(shí)驗(yàn)成功建立肝轉(zhuǎn)移模型。除陰性對(duì)照組外, 各組 肝轉(zhuǎn)移率分別為 100.   0%、8010%、7313%、6010%、8617%、7313%、7313% 和 6010%。中濃度

M CP 組、高濃度M CP 組、中濃度M CP+ ES 組、高濃度M CP + ES 組與陽(yáng)性對(duì)照組比較, 肝轉(zhuǎn)移灶數(shù)目均有明顯減少(P < 0105)。

213 脾臟腫瘤體積

除陰性對(duì)照組外, 各組脾臟種植瘤體積中位數(shù)分別為 1151 cm 3、0193 cm 3、0177 cm 3、0170 cm 3、1125 cm 3、1115 cm 3、0175 cm 3 和 0167 cm 3。中濃度M CP 組、高濃度M CP 組、中濃度M CP+ ES 組、高濃度M CP + ES 組與陽(yáng)性對(duì)照組比較, 脾臟種植瘤體積均有明顯縮小(P < 0105)。各組脾臟腫瘤體積比較見(jiàn)表1

A : 荷瘤小鼠與正常小鼠                 B: 脾臟原位腫瘤與肝轉(zhuǎn)移瘤          C: 肝轉(zhuǎn)移瘤病理圖像（HE*200）            D: 肝轉(zhuǎn)移瘤病理圖像(HE*400)

圖1 小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型

   注 (1) 3 與陽(yáng)性對(duì)照組比較, P < 0. 05; (2) 中濃度M CP 組與高濃度M CP 組比較、中濃度M CP+ ES 組與高濃度M CP+ ES 組比較、中濃度M CP 組與中濃度M CP+ ES 組比較、高濃度M CP 組與高濃度
M CP+ ES 組比較, 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)
214 肝轉(zhuǎn)移瘤組織中 ga lectin-3 表達(dá)
顯微鏡下觀察切片, 腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)染成棕黃
色顆粒認(rèn)定為表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞 (見(jiàn)圖2)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,
各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織 ga lect in23 表達(dá)無(wú)明顯差異 (P > 0105)。 各組肝轉(zhuǎn)移瘤 ga lect in23 表達(dá)比較見(jiàn)表 2。

注 各組間比較, 結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0. 05)
215 肝轉(zhuǎn)移瘤組織中 VEGF 表達(dá)和M VD 計(jì)數(shù)
  顯微鏡下觀察切片, 腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)染成棕黃色顆粒認(rèn)定為表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞 (見(jiàn)圖4)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,
各組肝轉(zhuǎn)移瘤組織 V EGF 表達(dá)無(wú)明顯差異 (P >0105) , 見(jiàn)表3。在200 倍光鏡視野下計(jì)數(shù)被CD 34 抗體 染成棕色的微血管數(shù)目 (見(jiàn)圖3)。經(jīng)分析, ES組、各濃度M CP + ES 組肝轉(zhuǎn)移瘤M VD 計(jì)數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組比較均有明顯減少 (P < 0105)。但各M CP 治療組與陽(yáng)性對(duì)照組比較則無(wú)明顯差異。 各治療組相互間比較無(wú)明顯差異見(jiàn)表4。

  注 (1) 3 與陽(yáng)性對(duì)照組比較, P < 0. 05; (2) 與陽(yáng)性對(duì)照組比較,M CP 治療組的M VD 計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0. 05); (3) 與 ES組比較 各M CP 治療組和M CP+ ES 治療組的M VD 計(jì)數(shù)均無(wú)明顯,
減少(P > 0. 05)
216 血清 ga lectin-3 濃度比較
根 據(jù) 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 回 歸 方 程 換 算 各 樣 本 血 清ga lect in23 濃 度, 各 組 血 清 ga lect in23 濃 度 分 別 為( 14163 ± 10108 ) LgöL、( 91101 ± 22194 ) LgöL、( 82175 ± 20133 ) LgöL、( 79101 ± 17164 ) LgöL、
(85194±15152) LgöL、(88195±2176) LgöL、(86150± 19180) LgöL、(84170±15157) LgöL 和 (93198 ±
16191) LgöL。經(jīng)檢驗(yàn), 陽(yáng)性對(duì)照組和各M CP 治療組血 清 ga lect in23 濃 度 明 顯 高 于 陰 性 對(duì) 照 組 ( P < 0101) ; 陽(yáng) 性 對(duì) 照 組 和 各 M CP 治 療 組 之 間 血 清ga lect in23 濃度均無(wú)明顯差異 (P > 0105)。
217 血清 VEGF 濃度比較
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程換算各樣本血清VEGF濃度, 各組血清V EGF 濃度分別為 (19150±4142)ngöL、( 411121 ±11198) ngöL、( 30172 ± 9175) ngöL、( 34180 ± 14189 ) ngöL、( 31193 ± 4176 ) ngöL、
(27197±6153) ngöL、(29157±6194) ngöL、(29177±7126) ngöL 和 (33117±10190) ngöL。 經(jīng)檢驗(yàn), 陽(yáng)性對(duì)照組和各M CP 治療組血清V EGF 濃度明顯高于陰性對(duì)照組 (P < 0101) ; 陽(yáng)性對(duì)照組和各M CP 治療 組 之 間 血 清 V EGF 濃 度 均 無(wú) 明 顯 差 異 ( P >0105)。
3 討 論
  結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移形成是一個(gè)多步驟、多因素的過(guò)程。 游離腫瘤細(xì)胞的聚集和黏附是轉(zhuǎn)移形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié), 其中黏附分子在腫瘤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵的作用[6];新生血管形成和營(yíng)養(yǎng)供給是轉(zhuǎn)移灶繼發(fā)生長(zhǎng)的重要原因, 也能為原位腫瘤細(xì)胞入血轉(zhuǎn)移提供條件。目前發(fā)現(xiàn)在多種高轉(zhuǎn)移 性腫瘤細(xì)胞 中 能 高 水 平 表 達(dá)ga lect in23[7], 腫瘤細(xì)胞表面的 ga lect in23 分子能直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間的識(shí)別聚集以及細(xì)胞與基底質(zhì)的黏附錨定作用, 并有一定誘導(dǎo)新生血管形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。修飾柑橘果膠M CP 是一種從柑橘類水果細(xì)胞壁中提取并經(jīng)特定處理的多糖纖維, 其半乳糖成分能競(jìng)爭(zhēng)性抑制體內(nèi) ga lect in23 配體與其受體結(jié)合, 從而封閉阻斷 ga lect in23 的功能表達(dá); 另外M CP 也可通過(guò)完全封閉 ga lect in23 位點(diǎn)以阻止腫瘤細(xì)胞從血管獲取營(yíng)養(yǎng) 對(duì)腫瘤生長(zhǎng)有一定的抑制作,用[8, 9]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)M CP 對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用。 體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí),M CP 具有抑制腫瘤細(xì)胞同型聚集作用和抑制腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、組織基質(zhì)黏附的作用[10]; 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明, 口服M CP 可抑制 鼠 前 列 腺 癌 和 人 乳 腺 癌、黑 色 素 瘤 的 自 發(fā) 轉(zhuǎn)移[11～ 13]。 重組人血管內(nèi)皮抑素是膠原— (co llagen— ) C 端 20kd 的連接蛋白, 能通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和分裂以抑制新生血管形成 阻斷腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供給, 從而達(dá)到抑制腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的作用。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn) ES 能抑制人微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和微血管形成[14] 而對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)直接殺傷作用。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)均證實(shí) ES 對(duì)多種腫瘤的進(jìn)展有明顯抑制作用[14, 15]。 而目前尚未有關(guān)于M CP 與ES 聯(lián)用對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移影響的研究報(bào)道, 故本實(shí)驗(yàn)首次就M CP 與 ES 對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響作初步研究。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 中、高濃度M CP 組, 中、高濃度M CP + ES 組的肝轉(zhuǎn)移數(shù)明顯少于陽(yáng)性對(duì)照組, 表明單獨(dú)使用一定濃度的M CP 或M CP 與 ES 聯(lián)用能有效抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成, 從而也提示通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞的黏附聚集和新生血管的形成也可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。 而中、高濃度M CP 組和中、高濃度M CP + ES 組的脾臟腫瘤體積與陽(yáng)性對(duì)照組比較有明顯降低, 顯示單獨(dú)使用一定濃度的M CP 或M CP與ES 聯(lián)用均可有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)。其機(jī)制可能是M CP 和 ES 能共同抑制腫瘤新生血管的形成 ，減少腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供給從而一定程度 抑 制 原 位 腫 瘤 的生長(zhǎng)。免疫組化和 EL ISA 結(jié)果均顯示 在有腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的情況下, 血清ga lect in23 和V EGF 的表達(dá)均較陰性對(duì)照組有明顯升高。但M CP 并未降低各組肝轉(zhuǎn)移瘤和血清ga lect in23 的表達(dá), 只能明顯抑制肝轉(zhuǎn)移 的形成, 過(guò)去 P la t t 等[13] 通過(guò)動(dòng) 物 實(shí) 驗(yàn) 也 證 實(shí)M CP 能有效抑制腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移, 但通過(guò)W estern B lo t 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M CP 對(duì)細(xì)胞 ga lect in23 的表達(dá)無(wú)影響。原因是M CP 只對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的ga lect in23 有封閉阻斷作用, 從而影響其生物學(xué)功能表達(dá), 但不影響細(xì)胞表達(dá)和分泌ga lect in23。同樣過(guò)去有研究也證實(shí) ES 能 有 效 降 低 腫 瘤 組 織 M VD , 但 并 未 影 響V EGF 的表達(dá)[2]; 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示各組肝轉(zhuǎn)移瘤  和血清V EGF 的表達(dá)也無(wú)明顯差異 但M VD 卻有下降趨勢(shì) 表明通過(guò)使用ES 能有效抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞形成微血管的形成 并一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但由于ES 的作用靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮細(xì)胞而非腫瘤細(xì)胞, 腫瘤細(xì)胞分泌表達(dá)V EGF 并不受影響, 這與傳統(tǒng)抗癌藥物通過(guò)直接殺傷腫瘤細(xì)胞減少V EGF 表達(dá)而引起M VD 降低的機(jī)制不同; 并且有觀點(diǎn)認(rèn)為這種抑制新生血管生長(zhǎng)會(huì)加重瘤體內(nèi)的相對(duì)缺氧, 反而會(huì)刺激腫瘤細(xì)胞分泌V EGF [15]。
  實(shí)驗(yàn)中低濃度M CP 組、ES 組、低濃度M CP + ES 組的腫瘤生長(zhǎng)和肝轉(zhuǎn)移情況與陽(yáng)性對(duì)照組比較未見(jiàn)明顯差異 但隨M CP 的濃度增加可見(jiàn)各指標(biāo)均有下降趨勢(shì)。而單用M CP 與M CP+ ES 治療對(duì)脾臟種植瘤生長(zhǎng)的影響并無(wú)顯著差異, 均可能與本實(shí)驗(yàn)樣本量較少、非參數(shù)檢驗(yàn)方法敏感性較低有關(guān), 需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究。
本研究結(jié)果表明, 單獨(dú)使用一定濃度的M CP 或M CP 聯(lián)合ES 能顯著抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成和腫
瘤生長(zhǎng), 并能抑制轉(zhuǎn)移瘤中M VD 數(shù)目, 提示通過(guò)同時(shí)阻斷腫瘤細(xì)胞的聚集黏附和抑制新生血管形成能有效抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的形成, 這將為臨床上防治結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移提供一個(gè)新的方向。M CP 作為一種來(lái)源于天然植物成分、高效低毒的藥物, 可望為治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移和其它惡性腫瘤轉(zhuǎn)移開辟新的方向,
并可根據(jù)腫瘤表達(dá) ga lect in23 的情況為患者提供個(gè)性化的治療策略。而ES 作為一種靶向藥物其效果也日益受到重視。但由于M CP 和ES 對(duì)腫瘤細(xì)胞均無(wú)直接殺傷作用 兩者如何聯(lián)合化療藥物提高對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的療效仍有待深入研究。
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·514· Journal of Practical Oncology Vol. 23 No. 6 2008

Inh ibitory effect of modif ied citrus pectin and endosta tin on l iver m eta sta s is from colon cancer
L IU Haiying, HUANG Zh iliang, YANG Guohua
(Departm ent of A bdom inal Surgery, T he A ffiliated Cancer Hosp ital of
Guangzhou M edical Co llege, Guangzhou, 510095, Ch ina)

Abstract: Objective To investigate the inh ibito ry effect of m odified citrus pectin (M CP ) com bined w ith endo statin
(ES) on liver m etastasis from co lon cancer in m ouse. M ethods CT 226 co lon cancer cells w ere injected into the subcap sule of
sp leen in Balböc m ouse to establish a co lon cancer liver m etastasis m odel. O ne hundred and th irty2five m ouse w ere divided into 9 group s random ly: negative contro l group , po sitive contro l group , low M CP group , m edium M CP group and h igh M CP
  group , ES group , low M CP + ES group , m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group. T he concentrations of M CP in w ater w ere 0. 0, 0. 0, 0. 01, 0. 025, 0. 05, 0. 0, 0. 01, 0. 025, 0. 05 göL , respectively. T he concentration of ES w as 2 m gökg,
injected into the abdom inal cavity once every 2 days. T he liver m etastasis w as observed after 3 w eek s. T he exp ressions of galectin23, vascular endo thelial grow th facto r (V EGF ) and tum o r m icrovessel density (M VD ) in liver m etastasis w ere
  exam ined w ith tissue m icroarray technique and imm unoh istochem istry. T he concentrations of galectin23 and V EGF in serumw ere detected by enzym e linked imm uno so rbent assay (EL ISA ). Results T he percentage of liver m etastasis in each groupw as 100. 0% , 80. 0% , 73. 3% , 60. 0% , 86. 7% , 73. 3% , 73. 3% , 60. 0%. T he num ber of liver m etastases in h igh M CP group ,m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group w as significantly few er than that in po sitive contro l group (P < 0. 05).  T he num ber of liver m etastases in h igh M CP + ES group w as significantly few er than that in h igh M CP group (P < 0. 05).
T he m edian vo lum e of sp leen im p lanted tum o r in each group w as 1. 51 cm , 0. 93 cm , 0. 77 cm , 0. 70 cm , 1. 25 cm , 1. 15 cm ,
0. 75 cm and 0. 67 cm . T he size of sp leen im p lanted tum o r in m edium M CP group , h igh M CP group , m edium M CP+ ES group and h igh M CP + ES group w as sm aller com pared w ith po sitive contro l group (P < 0. 05). T he exp ression of galectin23 and
V EGF in liver m etastasis in each group w as no t significantly different (all P > 0. 05). T he concentration of galectin23 and V EGF in serum in po sitive contro l group and all treatm ent group s w as significantly h igher than that of negative group (P <
  0101 ). T here w as no significant difference betw een the po sitive contro l group and treatm ent group s (all P > 0. 05). T he M VD counts in liver m etastases w ere 28 47±3 22 27 47±3 22 26 92±1 47 26 91±2 41 26 43±1 47 26 50±3 09
  . . , . . , . . , . . , . . , . . , 25145±1. 96 and 24. 73±3. 09, respectively. Com pared w ith po sitive contro l group , the M VD of liver m etastasis focus in ES group , low M CP + ES group , m edium M CP + ES group and h igh M CP + ES group w as significantly low er (P < 0. 05).
Conclusion M CP alone o r com bine w ith ES can inh ibit liver m etastasis from co lon cancer and angiogenesis effectively in m ouse.
Key words: co lonic neop lasm s; liver neop lasm sösecondary; liver neop lasm södrug therapy; pectins; endo statinsö
therapeutic use; gene therapy